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I più antichi resti di Ostia risalgono alla seconda metà del IV secolo a.C., quando Roma aveva già vinto gli Etruschi e i suoi domini si estendevano dalla bassa Toscana al Lazio meridionale. E', infatti, al 330-320 a.C. che sono datate le mura della nuova città alla foce del Tevere, eseguite in opus quadratum. Si trattava di un castrum, cioè di un tipico insediamento fortificato, costruito verosimilmente per controllare la via di accesso fluviale a Roma, con mura che formavano un rettangolo, con il lato più lungo parallelo al fiume, di 194 x 126 metri; esse erano costituite da grossi blocchi di tufo di Fidene (località sul Tevere a nord di Roma, oggi nei pressi del grande raccordo anulare).
All'interno erano un cardo ed un decumanus che, al loro incrocio, generavano un foro, cioè una piazza: questa struttura permarrà anche nella espansione urbana successiva. Mancano fonti storiche di questa fase di Ostia, che iniziò a divenire importante nel corso del III secolo a.C., quando Roma venne a contatto con le città della Magna Grecia, tra le quali Taranto (conquistata nel 272 a.C.); in quello stesso periodo iniziò ad esercitare la sua egemonia anche su tutta l'Italia meridionale, prefigurando il futuro scontro con Cartagine.
Nel 267 a.C. furono istituiti a Roma 4 “quaestores classici” (dal latino classis “flotta”, erano infatti i magistrati preposti alla sua cura) e fu organizzata la “provincia quaestoria ostiensis”; da allora uno dei quaestores risiedette a Roma stabilmente, il che dimostra l'importanza strategica della colonia. Nel 217 a.C., secondo lo storico Livio, da Ostia partirono navi per rifornire l'esercito romano che era in Spagna a combattere contro i Cartaginesi che sotto la guida di Annibale avevano conquistato la città di Sagunto.
Pochissime e frammentarie sono le notizie sulla città per il II e I secolo a.C., anche se la città dovette conoscere una notevole espansione edilizia al di fuori del castrum. Nell'87 a.C., durante le guerre civili che sconvolsero Roma, Mario a capo del partito dei populares conquistò la città essendosi in essa rifugiati i soldati del suo rivale Silla; poco dopo quest'ultimo la riconquistò, e la città fu abbandonata al saccheggio. Le cosiddette “mura sillane” furono infatti costruite nell'80 a.C. ed includevano un territorio di circa 69 ettari; nel 63 a.C. l'intero circuito fu ristrutturato sotto il consolato di Cicerone.
